Náplň podkapitoly:
1. Úvod do Krebsova cyklu
2. Reakce Krebsova cyklu
3. Regulace Krebsova cyklu
_
Úvod do Krebsova cyklu
Krebsův cyklus (KC, citrátový cyklus, cyklus kyseliny citronové – CKC) je metabolická dráha lokalizovaná v matrix mitochondrie. Za fyziologických podmínek probíhá téměř ve všech buňkách organismu – kromě erytrocytů, jež mitochondrie postrádají. Dalším významným faktem je potřeba aerobních podmínek pro hladký běh Krebsova cyklu (důvod si přiblížíme dále v textu – viz část o regulaci KC). V buňkách trpících z jakékoliv příčiny nedostatkem kyslíku tedy KC probíhá jen omezenou rychlostí.
Krebsův cyklus plní v buňkách mnoho funkcí. Zjednodušeně můžeme říci, že KC je srdcem energetického metabolismu buňky – nějakým způsobem se na něj napojují téměř všechny dráhy energetického metabolismu. Jako příklad lze uvést dýchací řetězec, glukoneogenezi, transaminace a deaminace aminokyselin či lipogenezi. Z tohoto důvodu se také u Krebsova cyklu nedá jednoznačně určit, zda se jedná o anabolickou či katabolickou dráhu. Protože plní obě funkce (katabolickou i anabolickou), používáme pro něj pojem amfibolická dráha (blíže viz: Kapitola 2: Podkapitola 2. Přehled energetického metabolismu). Nyní si uvedeme některé funkce Krebsova cyklu:
1) Oxidace acetylových zbytků (dodávaných ve formě acetyl-CoA)
V KC probíhá oxidace acetylových zbytků (CH3-CO-) až na CO2. Tato oxidace se stává zdrojem redukčních ekvivalentů, které jsou přeneseny na kofaktory NAD+ či FAD za vzniku redukovaných forem těchto kofaktorů – NADH + H+ a FADH2. Redukované kofaktory následně sytí dýchací řetězec (DŘ), kde se regenerují – reoxidují, a představují tedy vzájemné propojení obou drah (KC a DŘ). Krebsův cyklus je hlavním dodavatelem redukovaných kofaktorů pro DŘ, a proto i významných zdrojem ATP pro buňku (ač v samotném KC vzniká přímo jen jedno GTP na jednu jeho „otočku”).
2) Mnoho katabolických drah vyúsťuje do Krebsova cyklu
Mnoho katabolických drah produkuje meziprodukty KC či metabolity, jako je pyruvát (Pyr) a acetyl-CoA. Ty mohou být jednak oxidovány na CO2 (viz funkce 1), jednak využity jako substráty pro syntézu jiných látek (viz funkce 3).
3) Krebsův cyklus dodává prekurzory do mnoha významných anabolických drah
Jako příklady můžeme zmínit glukoneogenezi (novotvorbu glukózy), biosyntézu tetrapyrrolů (hemu), tvorbu mnoha aminokyselin (např. glutamátu, současně i nejhojnějšího excitačního neurotransmiteru v mozku) či dodávku acetyl-CoA do syntézy mastných kyselin.
4) Krebsův cyklus se účastní vylučování aminodusíku
KC je úzce propojen na cyklus syntézy močoviny a na tvorbu glutamátu, což jsou dvě hlavní formy sloužící k vyloučení dusíku z aminokyselin z těla.
Historická korelace:
Krebsův cyklus nese jméno sira Hanse Adolfa Krebse (1900-1981), německého, později anglického lékaře a biochemika. Ten byl v roce 1953 oceněn Nobelovou cenou za fyziologii a medicínu „for his discovery of the citric acid cycle“. Cenu obdržel společně s německým, později americkým biochemikem Fritzem Albertem Lipmannem, jenž ji získal „for his discovery of co-enzyme A and its importance for intermediary metabolism“.
_
Reakce Krebsova cyklu
Souhrnná rovnice popisující Krebsův cyklus je následující:
CH3-CO~SCoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O → 2CO2 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + GTP
Většina acetyl-CoA, který dodává acetylové zbytky do KC, pochází z ß-oxidace mastných kyselin a z pyruvátdehydrogenázové reakce (tyto procesy taktéž probíhají v matrix mitochondrie).
Pyruvátdehydrogenázová reakce
Jedná se o nevratnou oxidativní dekarboxylaci pyruvátu, jejíž průběh zachycuje následující rovnice:
CH3-CO-COOH + NAD+ + HSCoA → CO2+ NADH + H+ + CH3-CO~SCoA
Pokud propojíme pyruvátdehydrogenázovou reakci a souhrnnou reakci Krebsova cyklu, získáme rovnici popisující kompletní oxidaci pyruvátu:
CH3-CO-COOH + 4NAD+ + FAD + ADP + Pi + 2H2O → 3CO2 + 4NADH + 4H+ + FADH2 + ATP
Jednotlivé reakce Krebsova cyklu
Oxidace acetylových zbytků probíhá přes několik mezikroků:
1) Acetylový zbytek (2C) je přenesen na oxalacetát (4C) za katalýzy enzymem citrátsyntázou – vzniká citrát (6C). Tato kondenzační reakce je navíc nevratná – regulační reakce.
2) Citrát izomerizuje na isocitrát přes akonitát za katalýzy enzymem akonitát-hydratázou (akonitáza). Tato reakce je volně reverzibilní.
3) Isocitrát je oxidován na α-ketoglutarát za katalýzy enzymem isocitrátdehydrogenázou Jedná se o oxidační dekarboxylaci – oxidace -OH skupiny isocitrátu na ketoskupinu (vzniká NADH + H+) za současného odštěpení jedné karboxylové skupiny ve formě CO2. Reakce je nevratná – nejdůležitější regulační reakce.
4) α-ketoglutarát je oxidován na sukcinyl-CoA za katalýzy α-ketoglutarátdehydrogenázou (multienzymový komplex). Tato reakce je taktéž oxidační dekarboxylace – dochází k odštěpení další molekuly CO2 a vzniku NADH + H+. Reakce je opět nevratná a regulační.
5) Přeměna sukcinyl-CoA na sukcinát a koenzym A za katalýzy sukcinyl-CoA-ligázou je typickým příkladem substrátové fosforylace (vratná reakce). Vzniká GTP, který může být přeměněn na ATP.
V dosavadních reakcích došlo ke kompletní oxidaci acetylového zbytku na 2 CO2 a oxalacetát byl redukován na sukcinát. Následující tři reakce regenerují oxaloacetát ze sukcinátu.
6) Oxidace sukcinátu na fumarát pomocí enzymu sukcinátdehydrogenázy (integrální protein ve vnitřní mitochondriální membráně, je součástí DŘ – komplex II). Jeho kofaktorem je FAD – vzniká FADH2.
7) Adicí vody na dvojnou vazbu ve fumarátu vzniká malát za katalýzy enzymem fumaráthydratázou (fumaráza).
8) Malát je oxidován na oxalacetát pomocí enzymu malátdehydrogenázy – vzniká NADH + H+. Touto reakcí je Krebsův cyklus uzavřen a může znovu začít od první reakce.
Produkty Krebsova cyklu
V jedné otočce Krebsova cyklu (na jeden acetylový zbytek) vznikají 2 CO2, 3 NADH + H+, 1 FADH2 a 1 GTP (možno směnit za ATP).
Oxid uhličitý difunduje z mitochondrie a na konci je vyloučen v plicích. Redukované kofaktory (NADH + H+, FADH2) sytí dýchací řetězec, který následně tvoří ATP. V knihách uváděná energetická bilance KC (přímá tvorba GTP a vznik ATP v DŘ) se pohybuje mezi 10-12 ATP na jednu molekulu acetyl-CoA. Jak se nicméně uvádí v podkapitole 2/7, je celá situace mnohem složitější a přesné číslo je poměrně problematické určit.
Doplňovací (anaplerotické) reakce
Meziprodukty KC se v mitochondrii vyskytují jen ve velmi malých množstvích. Během oxidace acetylových zbytků dochází k jejich konstantní regeneraci, a proto se jejich koncentrace udržují relativně stabilní v průběhu času. Na druhé straně anabolické dráhy vytvářejí hlavní odtok meziproduktů z KC – např. sukcinyl-CoA → syntéza hemu, oxalacetát → glukoneogeneze atd. Reakce, které doplňují tyto ztráty meziproduktů KC, se nazývají anaplerotické (doplňovací):
1) Karboxylací pyruvátu vzniká oxaloacetát, reakci katalyzuje enzym pyruvátkarboxyláza (kofaktorem je biotin – vitamin B7):
Pyruvát + CO2 + ATP → oxaloacetát + ADP + Pi
2) Některé meziprodukty KC (oxalacetát, α-ketoglutarát, fumarát) vznikají z uhlíkatých koster aminokyselin – například aspartát může být transaminován na oxaloacetát či glutamát na α-ketoglutarát
3) Vznik sukcinyl-CoA z propionyl-CoA, jenž se tvoří během degradace mastných kyselin s lichým počtem C-atomů
_
Regulace Krebsova cyklu
Regulačními body (enzymy) Krebsova cyklu jsou:
1) Citrátsyntáza
2) Isocitrátdehydrogenáza
3) α-ketoglutarátdehydrogenáza
Regulačními faktory Krebsova cyklu jsou:
1) Poměr NADH / NAD+ – respirační kontrola
2) Poměr ATP / (ADP a AMP) – energetická kontrola
3) Dostupnost substrátů Krebsova cyklu – substrátová kontrola
1) Poměr NADH / NAD+ – respirační kontrola
Logickým pokračováním Krebsova cyklu je dýchací řetězec, kde dochází k reoxidaci redukovaných kofaktorů. Pokud se hromadí NADH + H+ a FADH2 (↑ poměr NADH / NAD+), dojde k inhibici α-ketoglutarátdehydrogenázy a isocitrátdehydrogenázy.
2) Poměr ATP / (ADP a AMP) – energetická kontrola
Je-li dostatek energie, inhibuje se α-ketoglutarátdehydrogenáza a isocitrátdehydrogenáza – ATP je jejich inhibitorem, ADP a AMP jsou naopak aktivátory.
3) Dostupnost substrátů Krebsova cyklu – substrátová kontrola
Substrátová kontrola leží na úrovni citrátsyntázy, která produkuje tolik citrátu, kolik jí dodáme oxaloacetátu a acetyl-CoA.
Aktivita Krebsova cyklu rovněž těsně souvisí s dostupností O2, ačkoli žádná z reakcí v cyklu nevyžaduje O2. Kyslík se ale vyžaduje pro respirační řetězec, protože zde slouží jako finální akceptor elektronů. V respiračním řetězci se reoxidují NADH → NAD+ a FADH2 → FAD. Jestliže buňka postrádá O2, klesá koncentrace NAD+ a FAD a následně se sníží i aktivita Krebsova cyklu.
_
Autor podkapitoly: Josef Fontana a Petra Lavríková
